酸枣仁药理作用研究进展综述(酸枣仁黄曲霉毒素怎么消除)
导语：肠道菌群介导的酸枣仁总黄酮体内代谢轮廓研究
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子，具有养心安神，敛汗、生津之功效[1]。酸枣仁富含皂苷、黄酮、生物碱和脂肪酸等活性成分[2]。黄酮类成分在酸枣仁中含量较高（质量分数可达3.94%），且具有镇静催眠、抗焦虑、抗抑郁、抗氧化和改善学习记忆等多种药理活性[3-7]。迄今，已从酸枣仁中分离鉴定了34种黄酮类成分，多为以芫花素为母核的C-6/8位碳糖苷黄酮，尚含有少量的C-3/7位的氧糖苷黄酮化合物[8]。
酸枣仁黄酮药理活性广泛，但体内代谢过程研究表明其入血吸收困难，生物利用度低[9]。Zhang等[10]研究表明正常大鼠ig斯皮诺素20 mg/kg后，其绝对生物利用度仅为2.20%。正常大鼠分别iv斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素单体（5 mg/kg）后，两者表现出相同的药动学趋势，均在0.75 h快速减少。此外，6′′′-阿魏酰斯皮诺素最大血药浓度（Cmax）明显低于斯皮诺素，与ig酸枣仁黄酮提取物的结果一致[11]。本课题组前期研究也表明正常大鼠ig酸枣仁水提物（生药量30 g/kg）后，斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素的Cmax分别为（45.22±7.94）、（15.83±1.54）ng/mL[12]。由此可见，酸枣仁黄酮研究中存在药动学与药效学相矛盾的现象，对阐明酸枣仁黄酮类成分的药效物质基础和作用机制提出了挑战。
肠道菌群作为“人体肝脏以外的第2个代谢性器官”，富含大量与物质代谢相关的酶系[13]，因此对po药物的代谢转化及吸收有重要影响。大部分酸枣仁黄酮具有C-6位碳糖苷的母核结构，同时又具有酚羟基。正常肠道菌群对黄酮类成分的代谢反应，一般包括糖基化反应、去甲基化反应、还原反应以及环裂变反应等[14-16]。
本课题组前期研究酸枣仁水提物的体外肠道菌群代谢转化，发现以斯皮诺素为母核的C-糖黄酮苷和以山柰酚为母核的O-糖黄酮苷，均可被肠道菌群代谢转化为次级黄酮苷[17]。Bao等[18]通过SD大鼠ig酸枣仁总黄酮180 mg/kg（相当于原生药30 g/kg），发现粪便中的代谢物在12 h最为丰富，且斯皮诺素和当药黄素在粪便中含量较高，表明其过程可能涉及了肠道菌群代谢。闫艳等[19]建立UHPLC-Q-Exactive轨道离子阱高分辨质谱分析酸枣仁水提物体内、体外成分，通过体内-体外物质组关联，在正常大鼠ig酸枣仁水提物后的尿液中共鉴定和推断出8个黄酮原型及4个代谢产物，并据此推断黄酮类化合物体内代谢反应主要为肠道水解和环裂解反应。因此，深入探讨肠道菌群对酸枣仁黄酮类成分的代谢特征及药动学的影响，对阐明酸枣仁药效物质基础和作用机制具有重要的科学意义。
本研究首先采用ig三联复合抗生素建立抗生素干预大鼠模型，利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术快速分析ig酸枣仁总黄酮后在正常与抗生素大鼠粪便中的原型及代谢产物。其次，建立采用UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中斯皮诺素含量的方法，并应用于正常与抗生素大鼠ig酸枣仁总黄酮后的斯皮诺素药动学比较研究。以期从肠道菌群代谢和药动学的角度，揭示肠道菌群对酸枣仁黄酮类成分吸收和代谢的影响。
一、正常与抗生素大鼠的菌群差异分析
1 菌群数量分析
在正常状态下，粪便微生物与菌群之间保持相对稳定的状态，并且与宿主之间保持相对平衡。当菌群发生改变，粪便微生物数量也随之改变。如图1所示，与正常组相比，抗生素组大鼠肠道菌群的分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）总数量显著降低（P＜0.01），表明抗生素组大鼠肠道菌群数量发生了明显的改变，抗生素大鼠模型制备成功。
2 菌群多样性分析
本研究肠道微生物群落的Alpha多样性分析以Chao指数、Observed_species指数（表征丰富度）及Shannon指数（表征多样性）进行评估。如图2所示，正常组大鼠肠道菌群中Chao指数、Observed_species指数及Shannon指数显著高于抗生素大鼠（P＜0.05），表明经抗生素干预后大鼠肠道菌群Alpha多样性降低，菌群稳态被破坏。
3 菌群差异分析
为了明确抗生素干预对大鼠肠道菌群的影响，利用微生物信息进行LEfSe分析。结果以显著差异物种LDA值分布柱状图（图3）进行展示。正常肠道菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形杆门和疣微菌门组成。LEfSe分析显示在正常大鼠粪便中包括厚壁菌门的乳酸杆菌属Lactobacillus、瘤胃球菌Ruminococcus、梭菌科梭菌属Clostridium、拟杆菌门的普雷沃菌属Prevotella、变形菌门的志贺氏菌属Shigella、放线菌门的安德克氏菌属Adlercreutzia、疣微菌门的阿克曼菌属Akkermansia等13种标志性差异菌属（LDA＞3，P＜0.05）。经抗生素干预后，大鼠肠道菌群的数量和组成均有显著改变，LEfSe分析显示仅有厚壁菌门的真细菌属Eubacterium和放线菌门的双歧杆菌属Bifidobacterium成为其标志性菌属（LDA＞3，P＜0.05），菌群组成稳态被破坏。
二、 正常大鼠与抗生素大鼠粪便中原型成分及代谢产物的鉴定
利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分别对酸枣仁总黄酮体外样品、正常组大鼠粪便样品、抗生素组大鼠粪便样品进行检测，基峰离子流图见图4。利用Metabolite Pilot软件对采集的正常组和抗生素大鼠组粪便原始数据进行分析，原型成分与代谢产物信息见表2。
首先，对已知成分采用对照品进行裂解规律分析。在正离子模式下，斯皮诺素、当药黄素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素均产生了碎片离子m/z 429.118 2、351.086 3、327.086 7和297.076 0。m/z 177.054 3为6′′′-阿魏酰斯皮诺素阿魏酰基的特征碎片离子。异牡荆素和牡荆素分别为以芹菜素为母核的C-6碳糖和C-8碳糖。在正离子模式下，两者通过丢失中性碎片-C5H10O5、-CO和-H2O，产生特征碎片m/z 337、313、283。维采宁II为以芹菜素为母核的C-6和C-8双碳糖类，m/z 337、325、295为其特征碎片[21]。以上黄酮碳糖类成分均有规律地脱去120（C4H8O4）、90（C3H6O3）和60（C2H4O2）产生碎片离子。此外，山柰酚-3-O-芸香糖苷为酸枣仁中代表性的黄酮氧糖苷类成分。在正离子模式下，其通过直接脱掉双糖苷产生m/z 287的特征碎片[22]。
参考以上裂解特征碎片及文献报道[23]，在2组粪便中快速表征和鉴别了24个化合物，其中9个原型成分和15个代谢产物。
由表2可知，在抗生素组大鼠粪便中鉴定了9种原型成分，分别为维采宁II（1）、斯皮诺素（2）、牡荆素（3）、异牡荆素（4）、当药黄素（5）、异当药黄素（6）和山柰酚-3-O-芸香糖苷（7）、6′′′-p-香豆酰斯皮诺素（8）及6′′′-阿魏酰斯皮诺素（9）；在正常大鼠鉴定了维采宁II（1）、斯皮诺素（2）、牡荆素（3）、异牡荆素（4）、当药黄素（5）、异当药黄素（6）及6′′′-p-香豆酰斯皮诺素（8）共7种原型成分。其中异当药黄素（6）及6′′′-p-香豆酰斯皮诺素（8）通过与文献比对鉴别[24]。
在正常组与抗生素组大鼠粪便中共鉴定了15种代谢产物。抗生素组大鼠粪便中11种代谢产物，即M1～M3、M5～M10和M14～M15，主要发生去甲基化、脱甲氧基、去羟基化等I相代谢反应及葡萄糖基化II相代谢反应。如图4所示，抗生素组大鼠粪便总离子流图信息更为丰富，抗生素大鼠中11种代谢物结构式及二级质谱图信息见图5、6。
三、 正常与抗生素大鼠体内药动学研究
对正常与抗生素组大鼠ig酸枣仁总黄酮后斯皮诺素的含量进行测定。应用DAS 3.2.8软件对药动学数据进行非房室模型拟合，计算药动学参数。采用SPSS软件对正常组与抗生素组的药动学参数进行统计分析。如图8所示，2组大鼠血浆中斯皮诺素的药时曲线均呈双峰吸收现象。如表6所示，与正常组比较，抗生素组大鼠血浆中斯皮诺素的Cmax显著降低（P＜0.05），Tmax、t1/2和MRT0～t显著增高（P＜0.05），表明在菌群破坏的情况下，斯皮诺素入血吸收明显减少，达峰时间延长。提示大鼠肠道菌群变化可导致酸枣仁黄酮成分的吸收减少和延迟，同时也更好地解释了抗生素组大鼠粪便中斯皮诺素的相对峰面积较正常组高的现象。
四、讨论
本研究探索了正常大鼠与抗生素大鼠ig酸枣仁总黄酮后粪便中原型成分及代谢产物种类的差异，结果显示抗生素组大鼠体内发生的反应类型及I相代谢产物明显多于正常组大鼠，并比较了具有改善睡眠和抗焦虑作用的活性成分斯皮诺素在正常大鼠与抗生素大鼠体内的药动学行为。
在正常与抗生素大鼠粪便中共鉴定了9种原型成分。共有原型成分维采宁II、斯皮诺素、异牡荆素、当药黄素、异当药黄素和6′′′-p-香豆酰斯皮诺素的平均峰面积在抗生素大鼠粪便中显著高于正常大鼠（P＜0.05）。研究报道酸枣仁中黄酮类成分可在体外被肠道菌群代谢，如O-糖苷类山柰酚-3-O-芸香糖苷可在体外肠道菌群作用下脱去芸香糖，进而发生环裂解反应，生成小分子酚酸类，并在24 h完全降解[26]；正常大鼠肠道菌群中优势种属如乳酸杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌科梭菌属等菌属中存在可以与黄酮C-糖苷和O-糖苷发生相互作用的酶系，参与包括糖基水解反应、去甲基化反应、脱羟基化反应、还原反应以及环裂变反应等多种代谢反应[27-31]。在抗生素干预下大鼠肠道菌群稳态环境受到破坏，对酸枣仁黄酮类成分的代谢转化能力降低[32-34]，这可能是原型成分在抗生素组大鼠粪便中峰面积显著高于正常组的主要原因。
2组大鼠粪便中共鉴定到15种代谢产物。正常大鼠粪便中检测到了5种代谢产物；抗生素大鼠粪便中鉴定到了反应类型更为丰富的11种代谢产物，包括较为特殊的脱甲氧基代谢产物及去羟基化代谢产物。Jin等[35]研究表明在伪无菌大鼠粪便中检测到丹酚酸A的脱甲氧基及去羟基化反应代谢产物，而在正常大鼠粪便中未检测到其代谢产物。已有文献报道肝脏中存在细胞色素P450等酶系，可以催化黄酮类成分发生脱甲氧基和去羟基化等I相代谢反应[36-37]，因此在抗生素大鼠粪便中这2种代谢产物可能主要由肝脏的代谢产生[38-39]。而在正常大鼠体内，脱甲氧基及去羟基化的代谢产物可能进一步被肠道菌群转化为下游代谢产物。
药动学结果显示，抗生素大鼠和正常大鼠血浆中斯皮诺素的吸收均呈现双峰吸收。与正常组相比，在抗生素大鼠血浆中斯皮诺素Cmax显著降低（P＜0.05），Tmax和t1/2显著增高（P＜0.05），表明在抗生素大鼠体内斯皮诺素吸收减少且消除减慢。Jiao等[40]研究发现6′′′-对香豆酰斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素等斯皮诺素衍生物，均可被由大鼠肠道菌群产生的β-葡萄糖苷酶体外催化发生脱糖基化反应转化为斯皮诺素。
本课题组研究亦发现肠道菌群可有效水解斯皮诺素衍生物的对香豆酰、阿魏酰和对羟基苯甲酰等基团，生成共同的代谢产物斯皮诺素；进而斯皮诺素可被水解生成当药黄素（6-C糖）[17]。本研究中抗生素干预大鼠的肠道菌群处于紊乱状态，菌群中优势菌门数量急剧下降[41-43]，包括有β-葡萄糖苷酶活性的如拟杆菌属Bacteroides、乳酸杆菌属、普雷沃菌属等菌属，从而减缓了对斯皮诺素及其系列衍生物的代谢转化速率，导致抗生素大鼠体内斯皮诺素Cmax与正常大鼠相比较低，并保持在比较稳定的水平。
本研究从肠道菌群代谢和药动学的角度，初步阐释了肠道菌群对酸枣仁黄酮类成分吸收和代谢的影响，同时也为酸枣仁总黄酮的药效物质基础及吸收代谢机制研究提供科学依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：肠道菌群介导的酸枣仁总黄酮体内代谢轮廓研究.
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