westeblot蛋白样品制备(wb蛋白样品-20可以保存多久)

导语：超强干货！WB实验操作——蛋白样品制备

Western Blot实验中，首先涉及到蛋白样品的制备相关问题。蛋白质量的好坏往往与最后实验结果紧密相关，那么如何提取样品中的蛋白及浓度测定成为关键一步！

＃蛋白质的提取＃

现在市面上有很多操作简便的蛋白质提取试剂盒（eg:全蛋白提取/浆蛋白/膜蛋白），可根据试剂盒说明书选择合适量的样本量＋蛋白裂解液＋酶抑制剂。

以最常用的高效PIRA裂解液＋蛋白酶抑制剂（PMSF）为例:

（索莱宝高效裂解液为例）

一、细胞蛋白质提取

①选取长势良好的细胞（可以在六孔板/T25培养瓶/T75培养瓶），弃上清，加入适量PBS洗两次，加入胰酶消化几分钟；加入少量培养基终止消化，将细胞悬液转至离心管中离心。

②弃上清；加入适量PBS重悬细胞后转至Ep管中，离心，弃上清，反复两次使细胞中大部分杂质去除。

③若提取细胞量约50万个左右，可加入200ul高效PIRA裂解液＋2ul PMSF，振荡混匀，置于冰上裂解30min；期间需将Ep管振荡混匀至少约3次。

④4°预冷离心机，将Ep管14000rpm离心10min。

⑤小心吸取上清于新Ep管/吸取上清并分装于微量离心管中，即为所提取的蛋白，弃沉淀。蛋白可储存于-80°。

二、组织蛋白提取

①取5～20mg组织，液氮研磨/无菌培养皿中剁碎，转入Ep管中。

②加入200ul高效PIRA裂解液＋2ul PMSF，振荡混匀，置于冰上裂解30min；期间Ep管需振荡混匀至少3次。

③4°预冷离心机，Ep管14000rpm离心10min。

⑤小心吸取上清于新Ep管/分装于微量离心管中，即为所提取蛋白，储存于-80°。

小结:蛋白质提取时，根据样品量可适当调整裂解液用量及酶抑制剂用量，通常裂解液:酶抑制剂=100:1。提取蛋白尽可能选取新鲜组织/细胞，提取整个过程尽量保持在低温（4°左右）。

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